，主要参与到烷基的羟化、烯基的环氧化、烃基的氧化、氧化性脱氨、脱卤和脱氢、氧化性的碳，碳键断裂及一些还原反应被发现，主要参与多环芳烃、烷烃、甾醇类化合物等初级、次级代谢产物的生物合成过程以及农药降解等方面在真菌子实体的形成过程中也具有调控作用，如通过基因敲除方法证实苹果腐烂病菌

  Poria cocos(Schw.) Wolf为多孔菌科药用真菌，是一种药食同源的大宗药材，其主要药用活性成分为茯苓多糖和三萜类化合物[18]，但关于其药用成分合成机制的研究较少。另一方面，由于对茯苓子实体的形成缺乏系统的研究，导致其遗传基础研究相对薄弱。本实验基于前期构建茯苓菌核和菌丝的转录组文库中发现的具有差异表达的CYP450超家族基因的全长开放读码框[19]，克隆获取了PcCYP1以及选择性剪切体PcCYP2的开放读码框全长序列，并就该基因的结构特征和功能进行初步分析，以期为进一步深入研究PcCYP基因的功能奠定基础。

  菌株和质粒茯苓P. cocos(Schw.) Wolf菌株GIM5.29购买自广东微生物所；大肠杆菌菌株DH5α购自上海唯地生物技术有限公司。1.1.2

  型恒温培养箱（武汉瑞华有限公司），HNYC-1102CD型振荡摇床（天津欧诺有限公司），DL-CJ-2N型超净工作台（北京东联哈尔有限公司），电泳仪和水平电泳槽（北京六一生物科技有限公司），CFX Connect荧光定量PCR仪、MyCycler普通PCR仪、凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），NanoDrop（美国Thermo Fisher公司），水浴锅（武汉鑫科有限公司），灭菌锅（上海三申有限公司），电子天平和pH计（美国奥豪斯公司），离心机（美国Bio-Rad公司），−80℃超低温冰箱（中科美菱有限公司）。

  、PDA和PDB培养基配方参考《基因工程实验指导（第2版）》。茯苓斜面菌株4℃保存，接种于PDA平板培养基上的茯苓菌株在28℃下培养，接种于PDB液体培养基中的在28℃、150 r/min条件下培养。大肠杆菌DH5α接种于LB培养基在37℃培养。2.

  PDA平板上培养7 d的茯苓菌丝，在液氮中速冻并充分研磨粉碎后使用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂提取RNA，提取方法参考其说明书进行。并用使用RevertAidTM第1链cDNA合成试剂盒合成第1链cDNA。获得的cDNA测定浓度后−20℃保存备用。2.

  ）和本课题组转录本测序结果筛选出在茯苓菌丝和菌核不同生长阶段差异表达的CYP450基因，选择其中一条基因PcCYP，根据其CDS序列设计基因特异性扩增引物PcCYP-F1和PcCYP-R1（表1），以cDNA为模板使用高保真酶进行扩增。PCR反应体系为25 µL 2×A8 PCR MasterMix，1 µL PcCYP-F1（10 µmol/L），1 µL PcCYP-R1（10 µmol/L），1 µL cDNA，总体积50µL。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，32个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，对符合目的大小的条带进行切胶回收。回收产物与pZERO-Blunt平末端载体连接，转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞，并涂布于含有50 μg/mL氨苄抗生素的LB固体培养基上，在37℃的培养箱中培养16 h。挑选单克隆进行菌落PCR鉴定，阳性菌株送于公司测序验证。

  2中的登录号在NCBI里下载不同线s氨基酸序列与本研究克隆得到的PcCYPs氨基酸序列比对，采用MEGA软件构建系统进化树（neighbor-joining，NJ），bootstrap设置为1000次[20]。

  基因序列和氨基酸序列同源性比对：；PcCYP基因编码蛋白的基本理化性质利用ExPASy数据库（）做多元化的分析；利用在线工具TMHMM Server 2.0（）、SignalP 5.0 Server（）、TargetP 2.0 Server（TargetP/）、NetPhos 3.1 Server（）分别进行蛋白质跨膜区、信号肽、亚细胞定位、磷酸化位点分析；利用CDD（）进行蛋白质保守结构域的分析。2.6

  基因克隆得到的2个不同剪切体（PcCYP1、PcCYP2）分别设计荧光定量引物PcCYP1-F/PcCYP1-R、PcCYP2-F/PcCYP2-R（表1）。以his3-1为内参基因[21]，利用qRT-PCR测定PcCYP基因不同转录本在液体发酵培养6、8、10 d的菌丝体中的相对表达量。仪器使用CFX96实时定量PCR仪（美国伯乐公司），qRT-PCR实验方法按照康为世纪公司RealSYBR Mixture的实验说明书进行，每个反应3次重复，PcCYP1、PcCYP2的相对表达量采用2−∆∆ C t法处理[22]。3结果与分析

  的茯苓菌丝体为材料提取RNA，从电泳检测结果（图1）可知28 S条带的亮度大约是18 S的2倍，表明RNA没有降解，完整性较好，能够适用于后续实验。

  基因CDS序列设计特异性引物，以反转录的cDNA为模板进行扩增，得到1个1600 bp左右的特异性条带，结果见图2。回收目的产物，克隆到平末端载体后送测序，测序结果为PcCYP基因的CDS有2种序列，其中较长的1条序列长度为1590 bp，编码529个氨基酸，而另1条较短的序列长度为1542 bp，编码513个氨基酸，初步推测PcCYP基因有几率存在选择性剪切。将该基因与由NCBI中茯苓基因组（gov/cgi-bin/dispGene Model?db=Wolco1&id= 131022）进行比对，发现PcCYP含有9个内含子和11个外显子，其中第9个外显子中的48 bp有几率存在选择性剪切，当该区域在转录过程中被剪切，就会形成新的转录本即PcCYP2（图3）。为了进一步验证是不是真的存在选择性剪切，在该区段的上下游设计特异性引物PcCYP-F2、PcCYP-R2（表1）进行扩增，PCR产物采用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。在100 bp和150 bp附近有2条条带，其中150 bp的PcCYP1基因片段亮度较弱，而100 bp的PcCYP2基因片段亮度较明亮，因此验证了选择性剪切的存在。

  的家族分类以及功能，本研究从线数据库中下载了来自不一样的物种且功能明确的60条CYPs氨基酸序列，并利用Clustal、Mega软件与PcCYP氨基酸序列进行比对分析和系统进化树的构建。结果如图5所示，来源于不一样的物种的CYP51、CYP52、CYP55、CYP53、CYP503等分别聚为一支，PcCYP与灰拟鬼伞菌Coprinopsis cinerea中eln2编码的CYP502比较相近，因此推测CYP可能属于CYP502家族基因。3.3

  PcCYP2CDS序列，翻译得到相应的2条氨基酸序列。使用ExPASY-ProtParam tool预测其蛋白基本理化性质，结果如表3所示，PcCYP1和PcCYP2相对分子质量分别为59 568.35和57 675.34，参考工具定义，当不稳定系数低于40时预测为稳定蛋白，超过40为不稳定蛋白，平均疏水性值为−2～2，负值表明该蛋白为亲水性蛋白，正值表示为疏水性，因此PcCYP1和PcCYP2均为不稳定亲水蛋白。同时，利用在线工具ProtScale预测蛋白一级结构上的亲疏性，结果（图6）表明大部分区域打分为负值，即表现为亲水性，与表3的结果一致。信号肽预测根据结果得出第1～17氨基酸为信号肽（图7）。跨膜结构域预测结果（图8）表明PcCYP1和PcCYP2均无跨膜结构。亚细胞定位预测根据结果得出PcCYP1和PcCYP2均存在于线粒体中。由于蛋白质磷酸化修饰在调节基因转录及改变蛋白质的功能方面具备极其重大作用，预测结果显示PcCYP1和PcCYP2均存在多个磷酸化位点，其中PcCYP1中包含苏氨酸（T）位点23个、丝氨酸（S）位点22个、酪氨酸（Y）位点11个；而PcCYP2基因由于缺失48 bp，所以预测的磷酸化位点包括苏氨酸（T）位点23个、丝氨酸（S）位点19个、酪氨酸（Y）位点10个（图9）。保守结构域分析如图10所示，PcCYP1的第295～473位和PcCYP2的295～457位氨基酸与CYP450超家族蛋白保守相似，属于CypX多保守域蛋白。此外，PcCYP1、PcCYP2均与pfam00067、PTZ00404具有部分相似位点，而由于选择性剪切基酸序列还与环二肽合成的CYP450（TIGR04538）具有相似位点。因此结合以上结果推测PcCYP1和PcCYP2经过不同的剪切方式翻译成不同的酶可能参与到线粒体中不同的反应途径。

  PcCYP2基因设计2对引物进行荧光定量PCR，由于PcCYP1比PcCYP2转录本多1个48 bp的内含子，因此，在此内含子中设计PcCYP1R，定量结果代表PcCYP1转录本的表达量。在PcCYP1和PcCYP2转录本的公共外显子区设计引物（PcCYP2F和PcCYP2R）的定量PCR结果代表2个转录本表达量之和，减去前面PcCYP1定量PCR的结果后，则为PcCYP2转录本线表明，PcCYP1在3个时间段的表达量无显著性差异。PcCYP2在不同发酵培养时间下的表达量具有显著差异，在培养10 d时PcCYP2表达量最高，而在培养8 d时表达量最低。与PcCYP1的表达量相比，在6、8 d时，PcCYP1与PcCYP2的表达量无显著差异，但10 d时PcCYP2表达量显著高于PcCYP1。4讨论

  细胞色素P450超家族基因广泛存在于生物体内，参与多种内源、外源物质的代谢途径中。随着真菌基因组学技术的发展，目前有399

  种CYP基因家族在2500种线、64等4个集团，各个集团又包含许多家族。而CYP51、56、59、61、67等家族是不归属于以上任何集团，其中CYP51和CYP61的进化较为保守，功能研究较透彻，主要参与到麦角甾醇的代谢途径中[24-25]。本研究基于课题组前期筛选出的具有差异表达的CYP450s基因，选择其中1条PcCYP基因进行了深入研究。本研究在对茯苓PcCYP转录本的克隆中首次得到了它的2个转录本：PcCYP1（第

  9个外显子完整）和PcCYP2（缺失48 bp），编码的蛋白质大小分别为59 560和57 660。通过与60种功能明确的线氨基酸序列进行比对和系统进化分析可知，PcCYPs与腐生菌灰盖鬼伞菌Coprinopsis cinerea的CYP502氨基酸序列相似度最大，进化分析也属于同一分枝，同属于伞菌纲。研究表明CYP502蛋白主要参与到Coprinopsiscinerea的子实体发育过程中，当编码CYP502蛋白的基因eln发生突变时，子实体的原基菌柄分化受到影响，菌柄细胞伸长能力减弱，菌柄变得短小[26]。因此推测PcCYP可能在茯苓子实体的生长发育过程中具有调节作用，但具体的功能需要进一步的实验验证。进一步对PcCYPs的基本特性分析得出PcCYP1和PcCYP2均属于P450超基因家族酶，且属于分泌型的不稳定的疏水蛋白。亚细胞定位分析发现PcCYP可能位于线粒体中，同时对其进行蛋白质修饰位点分析发现PcCYP具有多个磷酸化修饰位点。研究表明，线蛋白质在其氨基酸序列的氨基端（N端）具有一段疏水性螺旋区域和一段富含脯氨酸的区域，这种特征能够使蛋白很准确地锚定在细胞器（膜）上[27]，另一方面，分泌型的疏水蛋白可以通过水溶状态进行亲水/疏水两性分子界面的自我组装，从而在子实体的形成过程中发挥及其重要的作用[28]。蛋白质磷酸化是在蛋白激酶催化作用下，供体分子磷酸基团与蛋白质侧链中含有羟基的氨基酸发生酯化反应的可逆过程，属于翻译后修饰加工过程[29]。蛋白磷酸化修饰可以改变蛋白质的结构、活性及其与其他分子相互作用的能力，是一种动态的生物调节过程，在信号传导、基因表达、细胞分裂等许多生物学过程的调控中起着重要作用[30]。因此，结合PcCYP蛋白系统进化和基本特性分析，本课题组可知PcCYPs有极大可能参与到茯苓子实体的形成过程中，且在对PcCYP1、PcCYP1超表达菌株培养过程中，也偶然发现茯苓超表达菌株子实体的产生，但关于PcCYP1、PcCYP1基因在茯苓子实体形成过程中的具体作用，这需要后期更深入的基因功能研究加以佐证。另一方面，PcCYP1、PcCYP1的这些基本特性增加了其进行外源表达的难度，特别是大肠杆菌表达系统，因为原核生物缺乏翻译后修饰系统，所以CYP450在大肠杆菌中不表达或表达量低且不具有活性，但能够最终靠优化序列，变该酶的拓扑结构，实现该蛋白在原核系统中的表达[31-32]。前体mRNA的选择性剪切是真核生物转录后重要的加工环节，通过对外显子和内含子的选择性去除和保留，可以使一个基因产生多个成熟的mRNA，进而翻译成具有不一样功能的蛋白质，参与到不同的生物过程[33]。通过qRT-PCR分析PcCYP基因2种转录本在不同培养时间的表达量可知，PcCYP1的表达量随着培养时间的延长并没有显著变化，